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      實驗室離心機在蛋白表達系統中作用分析

      發布時間:2021-12-27 17:58:29??????點擊:

        蛋白表達的相關研究中可以看到離心機起到了重要作用。

        體外重組蛋白表達有四大系統:大腸桿菌表達系統,哺乳動物細胞表達,酵母表達系統及昆蟲細胞表達。

        今天我們要詳細講一下大腸桿菌表達系統。

        先從大腸桿菌表達系統步驟了解:

        不包括基因構建等上游操作和蛋白純化部分?;驑嫿▍⒖济艽a子優化,蛋白純化參考蛋白純化專題。以下內容主要包括蛋白表達鑒定:

        表達鑒定第一天的任務,常用抗性選擇根據感受態細胞選擇拿到質粒,實驗室離心機離心(3000r/min;2min)在質粒中加入TE(使質粒最終加入到110μL感受態細胞中的量為80-100ng,據此確定加入TE的量),一般為(1μg質粒加20μLTE;2μg質粒加50μLTE;5μg質粒加100μL TE)將質粒與TE混勻,加入2μL混液于感受態細胞中將感受態細胞放入冰箱(4℃)中,30min取出后立即放入水浴鍋中(42℃),熱激90s,再次放入冰箱(4℃)中,3min拿出后取200μL的LB液體培養基加入到已轉入質粒的感受態細胞中放入搖床(37℃;  195r)中,  30nim至60min; (最佳45min)取出離心(3000r/min;2min)去掉200μL的上清,留100μL左右上清懸浮沉淀,吸取50μL懸液涂平板,(先將對應抗性的平板放入培養箱(37℃)中預熱20min)把平板放入培養箱(37℃),過夜(12h至16h)。

        其次是表達鑒定第二天的任務,注意Pcold的表達溫度:

        每個平板挑取單菌落至4支對應抗性的L(4ml)試管中,編號為“0”“1”“2”“3”。

        將試管放入搖床(37℃;195r)中,(單抗3h左右;雙抗4左右;剛開始用可見分光光度計測OD值;熟練后可目測(背光下,以試管中的槍頭為例,剛剛看不見槍頭即可)),測OD值(0.6至0.8)。

        從“0”號管中取700μL懸液加入到100μL(C=80%)的保種甘油中,震勻,放入冰箱(-20℃)凍存。

        在每組菌的“1”“2”“3”號試管中分別加入2μL的IPTG(終濃度0.5mM最適)。

        視不同的載體選擇適合的表達環境(PET/PGEX:15℃表達過夜;25℃表達6h;37℃表達3h至4h(4支試管,“0”“1”號試管15℃表達過夜;“2”“3”試管37℃表達3h至4h)。Pcold:全部15℃表達過夜)。

        最后是表達鑒定第三天,全菌的表達鑒定分析,注意控制溶質的量及溶液黏度:

        從每組4支的試管中均取500μL菌液加入到1.5ml離心管中,(若OD值不一樣,值小的可多?。╇x心(6000r/min),5min, 去上清,留沉淀(沉淀少的,可再取菌液離心,盡量使沉淀量接近)。

        在每個離心管中加入500μL的DDH2O,懸浮沉淀,離心(6000r/min),5min, 去上清,留沉淀。

        在每支離心管中加入45μL的1×PBS和45μL的2×Loading Buffer懸浮沉淀(當溶質適量且均一的情況下,加入量不變;當溶質多且粘稠時,應使加入量增大,為降低粘度也可減少上液量)。

        放入煮樣器(100℃) 25min。

        取出后離心(6000r/min)  3min,  電泳檢測。

        從上述詳細步驟可以看出實驗室離心機在整個過程中都不能缺席。


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