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      休止細胞制備少不了離心機

      發布時間:2022-1-7 16:12:47??????點擊:

        休止細胞制備少不了離心機。

        休止細胞反應又稱靜息細胞,把培養液中各種營養物質和生長因子洗去后懸浮在生理鹽水中培養一段時間,以消耗內源營養物質,呈呈饑餓狀態的細胞,在研究微生物的生理生化及新陳代謝中有廣泛的應用。它的主要特性就是細胞雖然處于休眠狀態,不進行生長繁殖,但仍含有各種險系,其有氧化和發酵能力,在適宜條件下可再恢復生長。另外休止細胞反應專一性強,可以提高底物轉化率,不易染雜菌,可以減少產物對菌體生長及醇合成的抑制。

        培養基的制備及滅菌:

        按實驗材料中的培養基種類和數量配置相應培養基,進行滅菌。

        菌種活化和擴大化培養

        將E.coli cVcc249保藏菌種轉接到試管完全固體培養基斜面,37℃下培養18~24h.

        選取長勢良好的活化菌種轉接到LB液體培養基中,37℃振蕩培養16~18h。

        休止細胞的制備將三角瓶中的菌體倒入離心管中,4000rpm離心機離心15min,收集沉淀。

        85%生理鹽水洗滌沉淀三次,每次4000rpm離心機離心15min。

        用pH 7.0的磷酸緩沖液(PBS)20mL(用量根據使菌體數量而定)制備菌懸液,將制成的菌懸液放入4℃冰箱培養72hr,以降低內呼吸,制得休止細胞。

        底物的配制:

        分別配制濃度為0.1M的四種底物:乙酸鈉、琥珀酸鈉、α -酮戊二酸鈉和檸檬酸鈉。按照需要進行不同濃度梯度的稀釋。

        酶與底物反應:

        在5mL的離心管中,加入0.4ml的休止細胞和0.4ml底物,37℃恒溫30min;加入40ul噻唑鹽,振蕩混勻,在37℃下反應.2hr;反應完后,再離心管中加入1.5mL的二甲亞礬,混勻振蕩,并在37℃恒溫箱中保溫 30min;加入蒸餾水1.5ml。

        測定OD510值:

        按照分光光度計的使用說明,測定各個樣品的ODs1o值,并做好實驗記錄。

        整個實驗過程中一定要無菌操作,尤其是活化菌株時,因為所用的培養基為完全培養基,一般的微生物也能生長,為確保所測得的脫氫酶活性是來自于保藏菌種的,所以第一步活化菌種時一定要確保無菌操作。

        嚷唑鹽必須避光保存,因其見光易分解。另外,由于噻唑鹽和二甲基亞礬都有毒性,再加入這兩種試劑時,需戴手套進行操作。

        休止細胞反應實驗操作在洗滌細胞時,每次懸浮務必充分,否則容易造成洗滌不干凈,導致有殘存的營養物質,導致休止細胞的質量不好。

        在用分光光度計測量其OD值時,由于本實驗中所用的分光光度計適合的測量范圍在0.2~0.7中,在測量前需檢測下樣品的OD值是否在這個范圍內,如果過高,則加適量PBS稀釋。另外,在測量前,樣品需充分混勻,且動作要快,以免甲瓚又結晶出來,影響測量的結果??瞻讓φ諡檎麴s水。


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